Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium ở lúa (Oryza sativa L.) sử dụng hệ thống chọn lọc phosphomannose-isomerase

Abstract

In this study, several factors including callus treatment, light regimes during co-cultivation period and using mannose as the selective agent in regeneration medium were investigated for the transformation in japonica rice variety Taipei 309. Proliferated calli derived from the embryo scutella were inoculated with Agrobacterium tumefaciens carrying the vector containing a gene encoding phosphomannose isomerase (PMI). Only transformed cells were capable of utilizing mannose as a carbon source and callus induction frequency on selection medium RO5 was used to evaluate the gene transfer efficiency. The results indicated that the increase of gene transfer efficiency in wounded calli (7.3%) as compared to intact calli (3.7%). In co-cultivation period, the best result was obtained (9.3%) when callus was cocultured under continuous light regime. Shoot regeneration from transformed calli was 100% and 15.6% in medium RO6 and medium RO6 + 2% mannose, respectively. Similarity, the shoot proliferation rate was 97.8% and 11.1% in medium RO7 and medium RO7 + 1.5% mannose, respectively. A chlorophenol red (CPR) assay was used to confirm the activity of PMI gene, 100% of putative transgenic rice plants gave positive result. The presence of PMI gene was also evaluated by Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis, the expected 600bp fragment for the PMI gene was amplified from these putative transgenic rice plants.

Tóm tắt

Trong nghiên cứu này, các yếu tố bao gồm xử lý mô sẹo, chế độ ánh sáng trong thời gian đồng nuôi cấy và sử dụng mannose như là tác nhân chọn lọc trong môi trường tái sinh được khảo sát về sự chuyển gen ở giống lúa Taipei 309. Các mô sẹo từ phôi được chủng với Agrobacterium tumefaciens mang vector chứa gen mã hóa enzyme phosphomannose isomerase (PMI). Chỉ những tế bào được chuyển gen mới có thể sử dụng mannose như nguồn carbon và tần số mô sẹo hình thành trên môi trường chọn lọc RO5được sử dụng để đánh giá hiệu quả chuyển gen. Kết quả cho thấy có sự gia tăng hiệu quả chuyển gen ở mô sẹo bị tổn thương (7,3%) so với mô sẹo còn nguyên vẹn (3,7%). Mô sẹo được đồng nuôi cấy dưới chế độ sáng liên tục cho kết quả tốt nhất, hiệu quả đạt 9,3%. Sự hình thành chồi của các mô sẹo đã chuyển gen đạt 100% trên môi truờng RO6 và 15,6% trên môi truờng RO6 + 2% mannose. Tương tự có 97,8% chồi đã phát triển trên môi trường RO7 và 11,1% chồi phát triển trên môi trường RO7 + 1,5% mannose. Thử nghiệm chlorophenol đỏ đã xác nhận 100% dòng lúa được cho là chuyển gen có sự hoạt động của gen PMI. Phân tích PCR cũng cho thấy một đoạn DNA 600bp ở gen PMI được khuếch đại từ các dòng lúa này.