Trần Thị Mỹ Duyên * Trần Thị Tuyết Hoa

* Tác giả liên hệ (ttmduyen@ctu.edu.vn)

Abstract

This study is aimed to in vitro synthesize nanoluciferase (NanoLuc) reporter protein using cell-free protein synthesis system to develop biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. The template for protein synthesis was prepared by amplifying and column purifying the DNA fragment coding for NanoLuc. This result indicated that NanoLuc protein was successfully synthesized through its presence on CBB staining SDS page at 21 kDa and be able to emit light when react to Furimazine. The synthesized NanoLuc protein could detect antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis via some representatives including oxytetracycline, chloramphenicol and erythromycin. Specificity was also determined. This information gives a good starting point for further studies on development biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis; however, the effect of other parameters influencing on in vitro NanoLuc protein synthesis needs investigating.
Keywords: Biosensor, cell-free protein synthesis, chloramphenicol, erythromycin, Nanoluciferase, oxytetracycline

Tóm tắt

Nghiên cứu được thực hiện nhằm tổng hợp protein tín hiệu nanoluciferase trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro),  sử dụng hệ thống phiên mã dịch mã ngoài tế bào (cell-free synthesis) để ứng dụng tạo cảm biến sinh học nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn. Mạch mã khuôn cho quá trình tổng hợp protein được chuẩn bị bằng cách khuếch đại và tinh sạch đoạn DNA mã hoá cho protein nanoluciferase (NanoLuc). Kết quả đã xác định protein NanoLuc được tổng hợp thành công thông qua sự hiện diện trên gel SDS page nhuộm CBB với kích thước 21 kDa và có khả năng phát sáng khi tác dụng với cơ chất Furimazine. Khả năng nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn được xác định thông qua thử nghiệm nhận diện một số kháng sinh đại diện gồm oxytetracycline, chloramphenicol và erythromycin. Tính đặc hiệu của quá trình nhận diện được xác định. Mặc dù cần khảo sát thêm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein NanoLuc trong điều kiện in vitro nhưng kết quả này cũng tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra cảm biến sinh học có khả năng nhận diện nhóm kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn.
Từ khóa: cảm biến sinh học, hệ thống tổng hợp protein ngoài tế bào, chloramphenicol, erythromycin, Nanoluciferase, oxytetracycline

Article Details

Tài liệu tham khảo

Bell, D.A., and Demarini, D.M., 1991. Excessive cycling converts PCR products to random-length higher molecular weight fragments. Nucleic Acids. 19(18): 5079.

Carlson, E.D., Gan, R., Hodgman, C.E., and Jewett, M.C., 2011. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30(5): 1185-1194.

Duyen, T.T.M., Matsuura, H., Ujiie, K., Muraoka, M., Harada, K., and Hirata, K., 2017. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineer. 123(1): 96–100.

England, C.G., Ehlerding, E.B., and Cai W., 2016. NanoLuc: A small luciferase is brightening up the field of bioluminescence. Bioconjugate Chemistry. 27(5): 95–121.

Griss, R., Schena, A., Reymond, L., et al., 2014. Bioluminescent sensor proteins for point-of-care therapeutic drug monitoring. Nature Chemical Biology. 10: 598–603.

Hall, M.P., Unch, J., Binkowski, B.F., et al., 2012. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7(11): 1848–1857.

Hoa, P.T.P., Managaki, S., Nakada, N.,et al., 2011. Antibiotic contamination and occurrence of antibiotic-resistant bacteria in aquatic environments of northern Vietnam. Science of The Total Environment. 409(15): 2894–2901.

Hodgman, E., and Jewett, M., 2013. Cell-free synthetic biology: Thinking outside of the cell. Metabolic Engineering. 14(3): 261–269.

Kohanski, M.A., Dwyer, D.J., and Collins, J.J., 2010. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nature Review Microbiology. 8(6): 423–435.

Lorenz, T.C., 2012. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. 63: 1–15.

Lowell, A.N., Santoro, N., Swaney, S.M., et al., 2015. Microscale adaptation of in vitrotranscription/translation for high-throughput screening of natural product extract libraries. Chemical Biology and Drug Design. 86: 1331–1338.

McCoy, L.S., Xie, Y., and Tor, Y., 2011. Antibiotics that target protein synthesis. Wiley Interdiscipline Review RNA. 2(2): 209–232.

Nishikawa, K., and Ueda, T., 2001. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature. 19: 751–755.

Pardee, K., Green, A.A., Ferrante, T., et al., 2014. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159(4): 940–954.

Pardee, K., Green, A.A., Takahashi, M.K., et al., 2016. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165(5): 1255–1266.

Pham, D.K., Chu, J., Do, N.T., Brose, F., Degand, G., Delahaut, P., De Pauw, E., Douny, C., Van Nguyen, K., Vu, T.D., et al., 2015. Monitoring antibiotic use and residue in freshwater aquaculture for domestic use in Vietnam. Ecohealth. 12(3): 480–489.

Phu, T.M., Phuong, N.T., Scippo, M.-L., Dalsgaard, A., Thinh, N., and Huong, D., 2015. Quality of antimicrobial products used in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus)aquaculture in Vietnam. PLoS One. 10: 1-8.

Slomovic, S., Pardee, K., and Collins, J.J., 2015. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United State of America. 112(47): 14429–14435.

Suzuki, S., and Hoa, P.T.P., 2012. Distribution of quinolones, sulfonamides, tetracyclines in aquatic environment and antibiotic resistance in Indochina. Frontiers in Microbiology. 67(3): 1–8.

Uchida, K., Konishi, Y., Harada, K., et al., 2016. Monitoring of antibiotic residues in aquatic products in urban and rural areas of Vietnam. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 64(31): 6133–6138.