BIểU HIệN KHáNG NGUYÊN GRA7 CủA TOXOPLASMA GONDII TRONG Hệ THốNG PHI Tế BàO

Abstract

GRA7, belonging to family of dense granule antigenic protein of Toxoplasma gondii, was successfully expression as recombinant protein in E. coli. S. cerevesiae or Baculovirus systems. In this study, the GRA7 antigen of T. gondii was express in cell-free system. The GRA7 gene of 711bp in length was chemically synthesized based on cDNA sequence of T. gondii GRA7 gene. The specific primers containing BamHI and XhoI at the 5?-end have been used to amplify the GRA7 gene from vector of pT7CEF1-CHis with positive control of GFP. The size and sequence of GRA7 gene were confirmed by double restriction enzyme digestion and sequencing, respectively. The expression procedure was carried out with two steps of transcription and translation. RT-PCR using specific primers for GRA7 gene amplified target gene with appropriate molecular size. Western blot showed the band of 29 kDa corresponding to molecular weight of GRA7 protein. Positive ELISA result using swine anti-T. gondii polyclonal antibody and goat anti-swine HRPO conjugate with dilution of expressed GRA7 antigen in the range of 1,000-4,000 dilutions indicated the successful expression of GRA7 in cell-free protein synthesis system.

Tóm tắt

GRA7, protein kháng nguyên hạt dày đặc của Toxoplasma gondii- một loại ký sinh trùng máu ở động vật, đã được biểu hiện thành công protein tái tổ hợp ở các hệ biểu hiện khác nhau như E. coli, S. cerevesiae và Baculovirus. Trong nghiên cứu này, các kháng nguyên GRA7 của T. gondii được biểu hiện trong hệ thống phi tế bào. Gen mã hóa GRA7 T. gondii có kích thước phân tử 711 bp được tổng hợp hóa học dựa trên trình tự cDNA của gen GRA7 T. gondii. Cặp mồi đặc hiệu chứa vị trí nhận biết của BamHI và XhoI ở đầu 5'-đã được sử dụng để khuếch đại gen GRA7 từ vector pT7CEF1-Chis, sử dụng GFP là chuẩn dương tính. Kích thước phân tử và trình tự gen mã hóa GRA7 đã được xác nhận bởi enzyme cắt hạn chế BamHI và XhoI và đọc trình trình tự. Quá trình biểu hiện được tiến hành với hai bước phiên mã và dịch mã. Kết quả RT-PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen mã hóa GRA7 đã khuếch đại gen đích với kích thước phân tử phù hợp. Hình ảnh lai Western blott thấy xuất hiện băng kích thước khoảng 29 kDa tương ứng với trọng lượng phân tử của protein GRA7. Kết quả ELISA dương tính sử dụng kháng thể đa dòng lợn kháng T. gondii và cộng hợp HRPO với độ pha loãng kháng nguyên GRA7 trong khoảng1/ 1.000 -1/ 4.000x xác nhận sự biểu hiện thành công của GRA7 trong hệ thống tổng hợp protein phi tế bào.