Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch OsbHLH061, một nhân tố điều hòa phiên mã cảm ứng khô hạn ở lúa, trên vi khuẩn E. coli
,
và
Article Sidebar
Full Text: 
PDF
Abstract
OsbHLH061 is a transcriptional factor belonging to the basic helix-loop-helix (bHLH) family and is predicted to function in drought tolerance in rice. To elucidate the role and mechanism of OsbHLH061, it is essential to identify the DNA sequences bound explicitly by this protein, as this can help predict the target genes of OsbHLH061. Therefore, this study aims to clone and express OsbHLH061 in E. coli and purify the protein for in vitro protein-DNA interaction assays. The chosen expression vector was pET-32a due to the presence of protein tags that enhance solubility (Thioredoxin) and facilitate purification (Histidine). The results successfully cloned pET-HLH061 in E. coli, with OsbHLH061 designed to produce a fusion protein with Thioredoxin and Histidine at the N-terminus. The fusion protein was well expressed in the soluble phase and was successfully purified using Nickel affinity chromatography, yielding sufficient quality for the intended studies.
Tóm tắt
OsbHLH061 là một nhân tố điều hòa phiên mã thuộc họ basic helix-loop-helix (bHLH) và được dự đoán hoạt động trong quá trình chống chịu với hạn ở lúa. Nhằm làm rõ vai trò và cơ chế hoạt động của OsbHLH061, việc xác định các trình tự DNA liên kết đặc hiệu với protein này là rất cần thiết, vì từ đó có thể dự đoán được các gen mục tiêu của OsbHLH061. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm tạo dòng, biểu hiện OsbHLH061 trong E. coli và tinh sạch protein cho các phản ứng protein-DNA in vitro. Vector biểu hiện được lựa chọn là pET-32a vì sự có mặt của các protein thẻ làm tăng tính tan (Thioredoxin) và khả năng tinh sạch (Histidine). Kết quả đã tạo dòng thành công pET-HLH061 trong E. coli, OsbHLH061 được thiết kế để tạo protein dung hợp với Thioredoxin và Histidine ở đầu N. Protein dung hợp biểu hiện tốt trong pha tan và được tinh sạch thành công bằng phương pháp sắc kí ái lực với Nikel với chất lượng đủ cho các nghiên cứu mục tiêu được đề ra.
Article Details
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
Tài liệu tham khảo
Bervoets, I., & Charlier, D. (2019). Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology. FEMS Microbiology Reviews, 43(3), 304-339.
https://doi.org/10.1093/femsre/fuz001.
Do, T. T. H., Tran, T. T. A., Nguyen, T. H. V., Nguyen, Q. H., & Nguyen, V. S. (2017). Cloning, expression and purification of NF-κB p50 transcription factor from human using E. coli host cell. VNU Journal of Science: Natural Science and Technology, 33(1S), 299-304 (in Vietnamese).
He, H., Yang, M., Li, S., Zhang, G., Ding, Z., Zhang, L., Shi, G., & Li, Y. (2023). Mechanisms and biotechnological applications of transcription factors. Synthetic and Systems Biotechnology, 8(4), 565-577. https://doi.org/10.1016/j.synbio.2023.08.006.
Hellman, L. M., & Fried, M. G. (2007). Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols, 2, 1849–1861. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.249.
Helwa, R., & Hoheisel, J. D. (2010). Analysis of DNA-protein interactions: from nitrocellulose filter binding assays to microarray studies. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 398, 2551–2561.
https://doi.org/10.1007/s00216-010-4096-7.
Kim, J. S., Chae , S. H., Jun, K. M., Lee, G.-S., Joen, J.-S. & Kim, K. D., & Kim, Y.-K (2021). Rice protein-binding microarrays: a tool to detect cis-acting elements near promoter regions in rice. Planta, 253, 40.
https://doi.org/10.1007/s00425-021-03572-w.
Kim, J. S., Chae, S., Jun, K. M., Pahk, Y.-M., Lee, T.-H., Chung, P. J., Kim, Y.-K., & Nahm, B. H. (2017). Genome-wide identification of grain filling genes regulated by the OsSMF1 transcription factor in rice. Rice, 10, 16.
https://doi.org/10.1186/s12284-017-0155-4.
Kim, M. J., Chung, P. J., Lee, T.-H., Kim, T. H., Nahm, B. H., & Kim, Y.-K. (2012). Convenient determination of protein-binding DNA sequences using quadruple 9-mer-based microarray and DsRed-monomer fusion protein. Methods in Molecular Biology, 786, 65–77. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-292-2_4.
Kim, M. J., Lee, T.-H., Pahk, Y.-M., Kim, Y.-H., Park, H.-M., Choi, D. Y., Nahm, B. H., & Kim, Y.-K. (2009) Quadruple 9-mer-based protein binding microarray with DsRed fusion protein. BMC Molecular Biology, 10, 91. https://doi.org/10.1186/1471-2199-10-91.
Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., & Suzuki, Y. (2015). Cloning Should Be Simple: Escherichia coli DH5α-Mediated Assembly of Multiple DNA Fragments with Short End Homologies. PLoS One, 10(9):e0137466. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137466.
Li, X., Duan, X., Jiang, H., Sun, Y., Tang, Y., Yuan, Z., Guo, J., Liang, W., Chen, L., Yin, J., Ma, H., Wang, J., & Zhang, D. (2006). Genome-wide analysis of basic/helix-loop-helix transcription factor family in rice and Arabidopsis. Plant Physiology, 41(4), 1167-84. https://doi.org/10.1104/pp.106.080580.
Nguyen, D., P., Tuteja, N., Ham, L. H., & Pham, X. H. (2012). Expression and purification of recombinant protein NLI-IP from Escherichia coli. Journal of Biology, 34(3), 347-353 (in Vietnamese).
Pham, T. M. T. (2014). Characterization of a homeobox transcription factor OsWOX13 induced during acute dehydration in rice. Dissertation in Biological Science, Myongji University, Korea.
Samuelson, J. C. (2011). Recent developments in difficult protein expression: a guide to E. coli strains, promoters, and relevant host mutations. Methods in Molecular Biology, 705, 195-209. https://doi.org/10.1007/978-1-61737-967-3_11.
Sofia, C., André, A., António, C., & Lucília, D. (2014). Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system. Frontiers in Microbiology, 5, 63. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063.
Tu, Q. L., Vo., N., H., V., Nguyen, T. T., & Tran, V. H. (2022). Cloning, expression and purification of recombinant SCARB2 subunit receptor of enterovirus A71 fused with foldon peptide. Can Tho University Journal of Science, 58 (Natural Science), 1-7. https://doi.org/10.22144/ctu.jvn.2022.091 (in Vietnamese).
Young, C. L., Britton, Z. T., and Robinson, A. S. (2012). Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnol. J. 7, 620–634. https://doi.org/10.1002/biot.201100155
Yuan, S., Zhang, R., Cao, Y., Guo, Y., Xian, M., & Liu, W. (2020). New expression system to increase the yield of phloroglucinol, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 34(1), 405-412. https://doi.org/10.1080/13102818.2020.1764386.
Zuo, Z. F., Lee, H. Y., & Kang H. G. (2023). Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors: Regulators for Plant Growth Development and Abiotic Stress Responses. International Journal of Molecular Sciences, 24(2), 1419. https://doi.org/10.3390/ijms24021419.