Âu Dương Tuyết Mai , Nguyễn Lê Trâm Anh , Nguyễn Thị Thanh Giang * , Huỳnh Chí Thiện , Phạm Minh Chiến , Huỳnh Nguyễn Loan Anh Nguyễn Đăng Quân

* Người chịu trách nhiệm về bài viết: Nguyễn Thị Thanh Giang (email: nttgiang84@yahoo.com.vn)

Abstract

CRISPR/Cas 9 technology is has been increasingly used in gene editing technology. In this study, mouse embryo knockout Lep gene was generated by microinjecting a plasmid with the CRISPR/Cas9 construct directed at exon 3 of the gene site. The study used bioinformatics software to design 2 gRNAs, and cloned plasmids px330-gRNA-R and px330-gRNA-L capable of guiding the CRISPR/Cas9 system to direct removal of exon 3 with a length of 420bp, at positions 29070816 – 29071236 on the Lep gene. Mouse embryos were generated by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). After 6 h of ICSI, mouse embryos, zygote in two progenitor stages, were knockout gene by microinjection px330-gRNA-R and px330-gRNA-L plasmids at a concentration of 5 ng/µl into the male pronucleus. The PCR test showed that 36/72 (50%) the embryos were injected with plasmid removed the Lep genes. Thus, the study has successfully created mouse embryo knockout Lep gene in heterozygous zygote form.

Keywords: CRISPR/Cas9, Leptin, obesity, knockout mouse, injected

Tóm tắt

Kỹ thuật CRISPR/Cas 9 đang được sử dụng nhiều trong công nghệ chỉnh sửa gene. Trong nghiên cứu này, phôi chuột knockout gene Lep được tạo ra bằng cách vi tiêm plasmid có cấu trúc CRISPR/Cas9 hướng đến exon 3 của gene. Các phần mềm tin sinh học thiết kế 2 gRNA được sử dụng và tạo dòng được plasmid px330-gRNA-R và px330-gRNA-L có khả năng định hướng giúp hệ CRISPR/Cas9 loại bỏ đoạn exon 3 có chiều dài 420bp, ở vị trí 29070816 – 29071236 trên gene Lep. Phôi chuột được tạo ra bằng phương pháp bơm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI). Sau 6 h ICSI (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection), phôi chuột ở giai đoạn hợp tử hai tiền nhân, được knockout gene bằng cách vi tiêm plasmid px330-gRNA-R và px330-gRNA-L với nồng độ 5 ng/µl vào tiền nhân đực. Kết quả kiểm tra PCR các phôi có vi tiêm plasmid cho thấy 36/72 (50%) phôi đã được loại bỏ đoạn exon 3 gene Lep. Như vậy, nghiên cứu đã tạo thành công phôi knockout gene Lep ở dạng dị hợp.

Từ khóa: CRISPR/Cas9, Leptin, béo phì, chuột knock-out, vi tiêm

Article Details

Tài liệu tham khảo

Andrew Cho, Naoto Haruyama, Ashok B. Kulkarni. (2009). Geneeration of transgeneic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, 19, 11.

Crystal Ayres. (2019). 20 Biggest Pros and Cons of Transgenic Animals. Enviroment.

Lars M Ittner & Jurgen Gotz. (2007). Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nature protocols. vol2. 1206:1215.

Li-Fang, J.I. and Jin-Song, L. (2016). Generation of genetically modified mice using CRISPR/Cas9 and haploid embryonic stem cell systems. Zoological Research.  37 (4) 205.

Lonnqvist, F., Arner, P., Nordfors, L., and Schalling, M. (1995).  Overexpression of the obese (ob) gene in adipose tissue of human obese subjects. Nature medicine.  1 (9) 950-953.

Moon, H. S., Dalamaga, M., Kim, S. Y., Polyzos, S. A., Hamnvik, O. P., Magkos, F., Paruthi, J., and Mantzoros, C. S. (2013).  Leptin's role in lipodystrophic and nonlipodystrophic insulin-resistant and diabetic individuals. Endocrine reviews.  34 (3) 377 - 412.

Rajashekar B., Suhasini K. and Pattar Jayashree. (2013). Gene kicked mouse: Knockout mouse and its application. Int. Res. J. Pharm. 4(7).

Roh, J.I,  Lee, J., Park, S.U., Kang, Y.S., Lee, J., Oh, A.R., Choi, D.J., Cha, J.Y., Lee, H.W. (2018). CRISPR – Cas 9 - mediated geneeration of obese and diabetic mouse models. Exp Anim. 67(2):229-237.

Wang, H., Yang, H., Shivalila, C.S., Dawlaty, M. M., Cheng, A. W., Zhang, F., and Jaenisch, R. (2013). One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell.  153 (4) ,910-918

Wang, Y.C., McPherson, K., Marsh, T., Gortmaker, S.L., Brown, M. (2011). Health and economic burden of the projected obesity trends in the USA and the UK. Lancet. 378: 815-825.

Zhang, Z., Zhang, Y., Gao, F., Han, S., Cheah, K. S., Tse, H. F. and Lian, Q. (2017). CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: current status and future prospects. Molecular Therapy-Nucleic Acids.  9 , 230-241.