Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân được chiết từ máu ngoại vi người

Abstract

The purpose of this study is to optimize some conditions for human PBMCs in vitro culture. PBMCs were isolated within 4 hours from the EDTA – coagulated whole blood samples collected from the 10 healthy volunteers. 100 μL of a cell suspension (approximately 5x10⁵ cells/mL)were added to each well in a 96 well microplate and incubated at 37°C, 95±5% humidity and 5% CO₂ for 24 hrs. Then the isolation of PBMCs from 6 ml whole blood using 10 mL Leucosep^® tube was optimized; cell viability using trypan blue dye was evaluated; the suitable solvents for the dissolution of formazan crystals in the MTT assay and the conditions of PBMCs in vitro culture such as PBMCs density per well, FBS concentration, time for PBMCs culture and PHA mitogen concentration for PBMCs proliferation were examined. The results of this study showed that the centrifuge speed and time for isolating PBMCs from 6 mL whole blood using Leucosep^® tube was determined at 1200 xg for 20 minutes. After that, PBMCs viability was found above 95% using trypan blue and hemocytometer. The dissolution of formazan crystals in DMSO/NH₃ was better than in either DMSO, isopropanol or isopropanol/HCl. Moreover, the optimal conditions for cell culture media containing 10% FBS, 1.5% PHA mitogen and the range of PBMCs density from 10⁴ – 10⁵ cells/well were determined. These results may be used for the further studies to assess the effects of medicinal plants or new drugs on in vitro PBMCs proliferation.

Tóm tắt

Nghiên cứu được thực hiện nhằm tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân  được phân lập từ máu ngoại vi người (peripheral blood mononuclear cells - PBMCs). Các tế bào PBMCs được phân lập trong vòng 4 giờ từ khi thu thập máu toàn phần của 10 người tình nguyện đã được chống đông bằng EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) với ống Leucosep^® 10 mL. Cho 100 µL hỗn dịch 5x10⁵ tế bào/mLvào giếng trên đĩa 96 giếng, nuôi ở 37^oC, độ ẩm 95 ± 5%, 5% CO₂/24 giờ. Độ sống tế bào được khảo sát bằng phương pháp trypan blue, khảo sát dung môi hòa tan tinh thể formazan và các điều kiện nuôi cấy tế bào như nồng độ FBS (fetal bovine serum), mật độ tế bào PBMCs trong giếng, thời gian nuôi và nồng độ chất phân bào PHA (phytohaemagglutinin) cần cho sự tăng sinh PBMCs. Kết quả thu được: với vận tốc ly tâm 1.200 xg/20 phút, hơn 95% tế bào PBMCs được chiết từ 6 ml máu toàn phần được tìm thấy vẫn sống với hemocytometer. Sự hòa tan của formazan trong DMSO/NH₃ tốt hơn trong dung môi DMSO (dimethyl sulfoxide), isopropanol và isopropanol/HCl. PBMCs tăng trưởng tốt nhất trong môi trường nuôi cấy có FBS 10%, mật độ 10⁴-10⁵ tế bào/giếng và PHA 1,5%. Các điều kiện tối ưu này có thể ứng dụng cho các thử nghiệm khảo sát tác động của dược liệu hay chất hóa dược mới trên sự tăng trưởng tế bào PBMCs.