Effects of 60Co gamma doses on the growth and development of in vitro tuberose shoot clusters (Polianthes tuberosa L.), appearance of abnormal structures and LD50 determination
and
Article Sidebar
Full Text: 
PDF
Abstract
Tóm tắt
Article Details
References
Hình 1: Trình bày các mẫu cụm chồi được cấy trong mỗi dĩa petri để chiếu xạ
Khi các cụm chồi đạt được kích thước từ 1 đến 1,2 cm cao và 1 cm đường kính. Các cụm chồi được chọn tương đối đồng nhất về kích thước cây, sau đó cấy vào trong các dĩa petri có đường kính 8,5 cm và chiều cao 2 cm. Mỗi dĩa cấy 10 cụm chồi (Hình 1). Các liều chiếu xạ bao gồm 0 (đối chứng); 5; 15; 25; 40 và 60 Gy, suất liều 1,58 kGy/giờ (≈ 0,44 Gy/s). Việc xử lý chiếu xạ được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Complete randomized design, CRD) với 5 lần lặp lại và mỗi dĩa là một lần lặp lại. Từng cụm chồi sau khi chiếu xạ được cấy vào môi trường nuôi cấy bên trên để theo dõi sự sinh trưởng và phát triển.
Hình 2: Một cụm chồi sau khi chiếu xạ được cấy vào bao plastic chứa 100 ml môi trường cơ bản
Môi trường dinh dưỡng pha xong được chứa trong các bao plastic (polypropylene) có kích thước (15 cm x 25 cm). Mỗi bao plastic chứa 100 ml môi trường và cấy một cụm chồi. Sau đó các bao này được gấp lại ba lần (1,5 cm mỗi lần gấp) và dán lại bằng băng keo dính (Hình 2). Môi trường được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C, trong thời gian 20 phút.
Tất cả các bao plastic chứa các mẫu chiếu xạ được đặt trên các kệ dưới ánh sáng đèn huỳnh quang ở cường độ 1.500 lux, quang kỳ 16 giờ/ngày, nhiệt độ 30 ± 20C.
Phần trăm cụm chồi chết (%) = (Số cụm chồi chết/Tổng số cụm chồi được chiếu xạ)100. Cụm chồi chết là những cụm chồi mất sắc tố diệp lục chuyển sang màu nâu hoặc màu trắng và không phát sinh chồi mới.
Phần trăm cấu trúc bất thường (%) = (Số cụm chồi bất thường/Tổng số cụm chồi được chiếu xạ)100. Cụm chồi bất thường là các cụm chồi có biểu hiện khác thường được ghi nhận ở lá, rễ, chồi, sự chùn đọt ở chồi.
Chiều cao chồi đo từ mặt agar đến lá cao nhất (cm).
Số chồi đếm trên tổng số chồi của mỗi cụm.
Số lá đếm trên tổng số lá của mỗi cụm.
Tất cả các chỉ tiêu trên được ghi nhận ở ngày 50, 100 và 150 sau khi cấy.
Xác định LD50 của các liều chiếu xạ gamma 60Co ở 150 ngày sau khi cấy được tính theo phương pháp của Miller và Tainter, 1944 như mô tả bởi Randhawa (2009) và bảng biến đổi % chết sang giá trị xác suất theo Finney (1952). Trong đó cần xác định % hiệu chỉnh.
Công thức % hiệu chỉnh cho 0 và 100% chết.
Giá trị hiệu chỉnh =100x(% chết - % chết ở đối chứng/100 - % chết ở đối chứng)
Đối với 0% chết: (0,25/n)100; đối với 100% chết: (1 - 0,25/n)100 và n = 50
Bảng 1: Bảng biến đổi % chết sang giá trị xác suất (Finney, 1952)
Sai số chuẩn (Standard Error, SE) của LD50.
SE của LD50 có thể được tính từ công thức sau:
(log10 LD84 – log10 LD16)
SE của LD50 = (a)
<Object: word/embeddings/oleObject1.bin>
Trong đó: n là số cụm chồi trong mỗi nghiệm thức, n = 50.
Biến đổi liều chiếu xạ sang giá trị log10 và giá trị % hiệu chỉnh của cụm chồi chết sang giá trị xác suất bằng bảng biến đổi % chết sang giá trị xác suất (probit).
Xác định phương trình tương quan và hồi qui.
Tất cả số liệu được chuyển đổi sang căn bậc hai + 0,5 để đạt được phân phối chuẩn. Số liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0. Phép thử F và kiểm định Duncan ở xác suất 5%.
Chiều cao chồi
Bảng 2: Chiều cao chồi (cm) của các nghiệm thức khác nhau sau khi xử lý tia gamma 60Co theo thời gian (ngày)
Các số được theo sau cùng ký tự thì không khác biệt thống kê, (Duncan test, p < 0,05), *: ý nghĩa p ≤ 0,05; ns: không khác biệt
Bảng 2 cho thấy chiều cao chồi gia tăng theo thời gian ở tất cả các nghiệm thức xử lý các liều chiếu xạ khác nhau. Chiều cao chồi đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức 5 Gy và 15 Gy. Nghiệm thức không xử lý chiếu xạ, nghiệm thức 25 và 40 Gy có sự gia tăng chiều cao chồi nhưng không nhiều. Đặc biệt ở liều chiếu xạ 60 Gy chiều cao chồi gần như không gia tăng. Giải thích cho sự sinh trưởng bị hạn chế do ảnh hưởng của các liều chiếu xạ có thể liên quan đến chất điều hòa sinh trưởng nội sinh và DNA (Deoxyribo nucleic acid). Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ trên các phản ứng và cần thiết cho sự tổng hợp DNA và auxin (Jan et al., 2012).
Số chồi
Hiệu quả của các liều chiếu xạ lên sự gia tăng trên số chồi ở các thời điểm 50, 100 và 150 ngày nuôi cấy được trình bày ở Bảng 3. Có sự gia tăng về số chồi ở tất cả các nghiệm thức ngoại trừ nghiệm thức 60 Gy. Ở các liều chiếu xạ từ 0, 5 và 15 Gy, số chồi gia tăng theo thời gian ở tất cả các nghiệm thức và không có sự khác biệt thống kê giữa các nghiệm thức này ở 100 và 150 ngày nuôi cấy. Ở nghiệm thức 40 Gy, số chồi gia tăng tương đối nhỏ. Liều 60 Gy đã gây ảnh hưởng nhiều đến sự phát sinh chồi. Sự thành lập chồi trong in vitro thì liên quan đến một số chất điều hòa sinh trưởng nội sinh trong đó có nhóm cytokinin. Hasbullah et al. (2012) giả định là sự tổng hợp các chất này bị ảnh hưởng bởi sự chiếu xạ.
Bảng 3: Số chồi của các nghiệm thức khác nhau sau khi xử lý tia gamma 60Co theo thời gian (ngày)
Các số được theo sau cùng ký tự thì không khác biệt thống kê, (Duncan test, p < 0,05), *: ý nghĩa p ≤ 0,05; ns: không khác biệt
Số lá
Bảng 4 cho thấy sự hình thành lá mới của chồi hoa huệ theo liều chiếu xạ ở các mốc thời gian nuôi cấy. Số lá ở các liều chiếu xạ ở 50, 100 và 150 ngày sau khi cấy đều tăng. Liều chiếu xạ càng cao, sự hình thành lá càng ít dần, trừ số lá gia tăng ở nghiệm thức 40 Gy (6 lá) là khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các liều 5; và 15 Gy ở giai đoạn 50 ngày sau khi cấy. Nghiệm thức ở liều chiếu xạ 25 Gy có số lá tạo ít ở 50 và 100 ngày nuôi cấy nhưng lại tạo số lá nhiều nhất (khoảng 21 lá), có khác biệt không có ý nghĩa thống kê với liều chiếu xạ 15 Gy ở 150 ngày nuôi cấy. Mặc dù ở liều chiếu xạ gây chết hoàn toàn 60 Gy không cho sự gia tăng số chồi và chiều cao chồi nhưng vẫn có sự gia tăng số lá ở các thời điểm nuôi cấy 50, 100 và 150 ngày. Điều này là do số chồi chết không đồng thời một lúc, thời gian các chồi được xử lý chiếu xạ chết hoàn toàn trong 150 ngày nên trong thời gian này chồi vẫn có sự gia tăng về mặt sinh trưởng. Các chồi ở nghiệm thức này có sự gia tăng số lá nhưng rất ít (khoảng 0,4 lá; 0,4 lá và 0,3 lá ở 50; 100 và 150 ngày nuôi cấy theo thứ tự).
Bảng 4: Số lá của các nghiệm thức khác nhau sau khi xử lý tia gamma 60Co theo thời gian (ngày)
Các số được theo sau cùng ký tự thì không khác biệt thống kê, (Duncan test, p < 0,05), *: ý nghĩa p ≤ 0,05; ns: không khác biệt
Kết quả Bảng 5 cho thấy rằng phần trăm cụm chồi chết gia tăng khi liều chiếu gia tăng. Ở liều chiếu thấp nhất (5 Gy) có 6% cụm chồi chết và ở liều chiếu cao nhất (60 Gy), tất cả cụm chồi bị chết (100%). Hiệu quả của việc xử lý tia gamma trên sự sống sót tùy thuộc vào liều chiếu xạ. Khi liều chiếu xạ gia tăng sự sống sót giảm. Kết quả nghiên cứu này cũng giống với các kết quả nghiên cứu trên cây lai Torenia (Sawangmee, 2011) hay sự chết cụm chồi trên hai giống hoa huệ (Nguyễn Bảo Toàn và ctv., 2014) và cây Biomphalaria glabrata (Cantinha, 2009). Estrada-Basaldua (2011) báo cáo sau khi chiếu xạ củ cây hoa huệ, đem các củ con nuôi cấy in vitro và trồng ngoài nhà lưới có liều gây chết hoàn toàn là 30 Gy.
Bảng 5: Hiệu quả của các liều chiếu xạ tia gamma 60Co trên % của cụm chồi chết ở 150 ngày sau khi cấy
Bảng 6 trình bày các giá trị của liều chiếu xạ được biến đổi giá trị log10 và giá trị % chết sang giá trị xác suất. Hai giá trị ở 0 và 100% chết được hiệu chỉnh. Tất cả giá trị log10 và xác suất được sử dụng để tính tương quan và hồi qui và đạt được phương trình y = 3,188x + 0,725, R2 = 0,722 (Hình 3). Trên cơ sở phương trình này, giá trị LD50 đạt được ở liều 21,88 Gy.
Bảng 6: Kết quả liều gây chết của các tia gamma 60Co để xác định LD50
(-): không xác định
Tính sai số chuẩn (SE) của LD50 được tính từ công thức (a). Xác suất của 84 và 16 từ Bảng 1 là 5,99 và 4,01 (xấp xỉ 6 và 4), theo thứ tự. Giá trị log10-LD cho xác suất 6 và 4 đạt được từ đồ thị (Hình 3) là 1,66 và 1,02. Giá trị log10 ngược (antilog10) là 45,71 và 10,47. Sử dụng các giá trị này, SE của LD50 là 3,52. Do đó, LD50 của các tia gamma 60Co là 21,88 ± 3,52, với 95% khoảng tin cậy.
Thông thường giá trị LD50 trong xử lý chiếu xạ đạt được không giống ở tất cả các loài cũng như tất cả các mẫu cấy khi được xử lý bằng tia gamma do nó thay đổi từ loài này sang loài khác cũng như từ mẫu cấy này sang mẫu cấy khác. Estrada-Basaldua (2011) đã báo cáo khi xử lý chiếu xạ củ hoa huệ (có từ 2 - 21 củ con) bằng tia gamma 60Co rồi tách các củ con (không gây tổn thương) đem nuôi cấy in vitro và trồng ngoài nhà lưới, LD50 của các cây huệ được trồng từ các chồi thuần dưỡng sau nuôi cấy in vitro là 9,09 Gy, thấp hơn LD50 của các cây phát sinh từ củ được chiếu xạ và được trồng ngoài nhà lưới (25,91 Gy) sau thời gian 5 tháng. Nghiên cứu của Yanshan et al. (2003) đã tính toán các giá trị LD50 là 15 và 25 Gy trên cơ sở sự sống sót của củ lớn và củ nhỏ.
Xác suấtGiá trị log10 của liều chiếu xạ
Hình 3: Đồ thị tương quan hồi qui để xác định LD50 của các liều chiếu xạ khác nhau ở 150 ngày sau khi cấy
Kết quả Bảng 7 cho thấy rằng có 4 kiểu cấu trúc bất thường được ghi nhận dưới tác động của các liều bức xạ gamma khác nhau. Ở liều 5 Gy, không có xuất hiện cấu trúc bất thường. Ở liều chiếu xạ 15 Gy, có 27 cấu trúc bất thường chiếm 54% số mẫu được xử lý chiếu xạ. Ở liều 25 và 40 Gy, có hai cấu trúc bất thường (chùn đọt) chiếm 4% và ở liều 40 Gy, có 5 cấu trúc bất thường chiếm 10% số mẫu được xử lý chiếu xạ. Ở liều gây chết hoàn toàn 60 Gy, chồi hoa huệ mất sắc tố, chuyển sang màu nâu hoặc trắng hoàn toàn (chiếm 90% số chồi). Đồng thời, ở liều chiếu xạ này, 10% số chồi hoa huệ chết dần từ dưới gốc lên trên lá với đặc điểm là mô mất nước và xốp.
Các kiểu cấu trúc bất thường khác nhau gần như hoàn toàn về hình dáng ngoại trừ cấu trúc bất thường (4.3) và (4.4) thì hơi giống nhau (chùn đọt) nhưng khác nhau về lá không có răng cưa (4.3) và có răng cưa (4.4). Ở liều chiếu xạ cao, cấu trúc bất thường có dạng chùn đọt và hóa nâu (40 Gy). Ở liều chiếu xạ thấp (5 Gy) không có hiện tượng cấu trúc bất thường. Sự xuất hiện của các cấu trúc bất thường đã cho thấy rằng tia gamma ở các liều cao đã tác động lên tế bào và các thành phần của tế bào như lục lạp (gây ra sự mất sắc tố) hay acid nhân và ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào cũng như sự chuyên hóa.
Bảng 7: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thường ở các liều khác nhau ở 100 ngày sau khi cấy
ĐC123405
Hình 4: Các dạng cấu trúc bất thường của cụm chồi hiện diện ở các liều chiếu xạ khác nhau ở 150 ngày sau khi cấy
ĐC và (1): bình thường (Đối chứng và 5 Gy); (2): chồi ra rễ (15 Gy); (3): lá răng cưa và chùn đọt (25 Gy); (4): chùn đọt và mất sắc tố (40 Gy) và (5): mất sắc tố và hóa nâu (60 Gy)
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các liều chiếu xạ ảnh hưởng trên sự sinh trưởng của chiều cao chồi, số chồi và số lá. Liều chiếu càng cao sự sinh trưởng các thông số này càng giảm.
Trừ liều 5 Gy, hầu hết các liều còn lại đều gây ra các cấu trúc bất thường trong nuôi cấy in vitro. Điều này hy vọng sẽ có nhiều biến dị kiểu hình khi trồng ngoài đồng. Giá trị LD50 đạt được ở các liều xử lý chiếu xạ tia gamma 60Co là 21,88 ± 3,52 Gy.
Tài liệu tham khảo
Adisorn, K., 1992. Effect of gamma radiation on tuberose (Polianthes tuberose). Kasetsart Journal, Natural Sciences. 26(1): 6 - 11.
Anu, G. K., 2003. In vitro multiplication and genetic improvement of tuberose (Polianthes tuberose Linn.). Thesis of doctor of philosophy in Horticulture. Kerala Agriculture University. India.
Cantinha, R. S., Demir, A. A., Sueli, I. B., Eliana, N., Silva, L. R. S. and Melo, A. M. M. A., 2009. Effects of high dose rate gamma radiation on survival and reproduction of Biomphalaria glabrata. In: InternationalNuclear Atlantic Conference -INAC 2009. Rio de Janeiro, RJ, Brazil, September 27 to October 2, 2009.
Estrada-Basaldua, J. A., Pedraza – Santos, M. E., Cruz – Torres, E., Martínez – Palacios, E. and Morales – García, C. J. L., 2011. Effect of 60Co Gamma rays in tuberose (Polianthes tuberosa L.). In: Revista Mexicana de Ciencias Agricolas Pub. Esp. Num 31 de noviembre - 31 de diciembre, Mexíco. 445 - 458.
Finney, D. J., 1952. Probit Analysis. Cambridge, England, Cambridge University Press.
Hasbullah, N. A., Taha, R. M., Saleh, A., Mohamed, N., 2012. Physiological Responses of Callus from Gerbera jamesonii Bolus ex. Hook f. to Gamma Irradiation. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55(3): 411- 416.
Huỳnh Thị Huế Trang, Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn, 2007. Phục tráng giống huệ trắng (Poliananthes tuberosa Linn.) nhiễm bệnh chai bông bằng nuôi cấy phân sinh mô chồi. Hội nghị khoa học Công nghệ Sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa. NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. 141 - 154.
IAEA (International Atomic Energy Agency), 2005. Annual report 2005.
Ilyas, S. and Naz, S., 2014. Effect of gamma irradiation on morphological characteristics and isolation of curcuminoids and oleoresins of Curcuma longa L. The Journal of Animal & Plant Sciences. 24(5): 1396 - 1404.
Jan, S., Parween, T., Siddiqi, T. O., 2012. Effect of gamma radiation on morphological, biochemical, and physiological aspects of plants and plant products. Environmental Reviews. 20: 17 - 39.
Kainthura, P., Srivastava, R., 2014. Induction of Genetic Variability and Isolation of Mutants in Tuberose (Polianthes Tuberosa L.). Tropical Agricultural Research. 26(1).
Kiong, A., Pick, A. L., Lai, S. H. G., Harun, A. R., 2008. Physiological responses of Orthosiphon stamineus plantlets to gamma irradiation. American Eurasian Journal of Sustainable Agriculture. 2(2): 135 - 149.
Lê Lý Vũ Vi, Nguyễn Bảo Toàn, Trần Văn Hâu, Trần Sỹ Hiếu, Trần Thị Doãn Xuân, 2014. Nuôi cấy mô thực vật cây hoa huệ trắng (Polianthes tuberosa) trong điều kiện ánh sáng tự nhiên và đánh giá sự sinh trưởng qua mô hình canh tác. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. (4): 63 - 67.
Le Quang Luan, Nguyen Huynh Phuong Uyen, Vo Thi Thu Ha, 2012. In vitro mutation breeding of Paphiopedilum by ionization radiation. Scientia Horticulturae. 144: 1- 9.
Murashige, T., Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco culture. Plant Physiology. 15: 473 - 497.
Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Quang Thức, Đào Thị Tuyết Thanh, 2014. Xử lý tia gamma 60Co ở các liều chiếu xạ khác nhau trên cụm chồi hai giống hoa huệ (Polianthes tuberosa) in vitro. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. (4): 41 - 46.
Randhawa, M. A., 2009. Calculation of LD50 values from the method of Miller and Tainter, 1944. Journal of Ayub Medical College Abbottabad. 21(3): 184 - 185.
Sawangmee, W., Taychasinpitak, T., Jompuk, P. , Kikuchi, S., 2011. Effects of Gamma Irradiation in Plant Morphology of Interspecific Hybrids between Torenia fournieri and Torenia baillonii. Kasetsart Journal. (Natural Science). 45 : 803 - 810.
Singh P. K., Sadhukhan, R., A. Dudhane, S., Kumar, Sarkar, V. H. K., 2015. Preliminary S tudy on Mutagenic Effect of EMS on Tuberose (Polianthes tuberosea L.). Environment & Ecology. 33(3A): 1386 - 1390.
Sparow, A. H., Underbrink, A. G., Sparow, R. C., 1967. Chromosomes and cellular radiosensitivity. The relationship of dose to chromomosome volume and complexity in seventy nine different organism. Radiation Research. 32: 915 - 945.
Sparow, A. H., Rogers, A. F., Schwemmer, S. S., 1968. Radiosensitivity studies in woody plants. I. Acute gamma irradiation survival data for 28 species and prediction for 190 species. Radiation Botany. 8: 149 - 186.
Toker, C., Yadav, S. S., Solanki, I. S., 2007. Mutation breeding. In: Yadav et al. (Eds) Lentil: An ancient crop for modern times. 209 - 224.
Xu, L., Najeeb, U., Naeem, M. S., Wan, G. L., Jin, Z. L., Khan, F. and W. J. Zhou. 2012. In: In vitro mutagenesis and genetic improvement. S.K. Gupta (Ed.): Technological Innovations in Major World Oil Crops. (2): 151-173.
Yanshan, S., Jianxia, L., Guofang, Z., Guiping, Q., Xueen, L., 2003. Search for Proper Dose of 60Co Gamma Ray in Tuberose (Polianthes tuberose L.) Radiation Breeding. Acta Horticulturae Sinica. 6.