Trần Thị Tuyết Hoa * , Hong Mong Huyen Nguyễn Trang Huyền

* Tác giả liên hệ (ttthoa@ctu.edu.vn)

Abstract

This research was conducted to develop a duplex PCR assay that could simultaneously detect Streptococcus agalactiae and Streptococcus iniae, two causative agents of Streptococcosis on both of freshwater and brackishwater fish. The duplex-PCR amplified partial lactate oxidase (lctO) and 16s rRNA genes of S. iniae and S. agalactiae at 870 bp and 220 bp, respectively. Results showed that (i) the PCR reaction consists of the following components 1 X PCR buffer; 2 mM MgCl2; 250 µM dNTPs; 10 pm F1 and IMOD primers; 5 pm LOX-1 and LOX-2 primers; 1,0 U Taq polymerase, 1 μl S. agalactiae extracted DNA; 1 μl S. iniae extracted DNA, total reaction volume of 25 µl and (ii) the PCR cycle consists of 95oC for 5 min, followed by 35 cycles of 95oC for 1 min, 57oC for 1 min, 72oC for 1 min, and a final elongate step at 72oC for 7 min. The detection limits of the duplex PCR were in the range of 100 cfu/ml and 103 cfu/ml for S. agalactiae and S. iniae, respectively. The duplex PCR did not produce any specific amplification products when tested against Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus.
Keywords: Detection, fish tissue, PCR, Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae

Tóm tắt

Nghiên cứu thực hiện nhằm phát triển quy trình duplex PCR phát hiện đồng thời hai loài vi khuẩn S. agalactiae và S. iniae gây Streptococcosis trên cá nước ngọt và mặn. Quy trình khuếch đại sản phẩm dựa trên các gen lactate oxidase (lctO) và 16s rRNA của S. iniae và S. agalactiae tương ứng tại 870 bp và 220 bp. Nghiên cứu xác định được: (i) thành phần hóa chất phản ứng bao gồm: 1 X PCR buffer; 2 mM MgCl2;250 µM dNTPs; 10 pm mồi F1; 10 pm mồi IMOD; 5 pm mồi LOX-1; 5 pm mồi LOX-2; 1,0 U Taq polymerase; 1 µL DNA S. agalactiae chiết tách; 1 µL DNA S. iniae chiết tách, tổng thể tích phản ứng là 25 µL và (ii) chu kỳ nhiệt cho phản ứng duplex PCR: 95oC trong 5 phút, tiếp theo 35 chu kỳ: 95oC trong 1 phút, 57oC trong 1 phút, 72oC trong 1 phút và cuối cùng 72oC trong 7 phút. Độ nhạy của quy trình được xác định đối với S. agalactiae là 100 cfu/mL và S. iniae là 103 cfu/mL. Qui trình duplex PCR không khuếch đại sản phẩm đặc hiệu khi kiểm tra với Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus.
Từ khóa: mô cá, PCR, phát hiện, Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae

Article Details

Tài liệu tham khảo

Akkarawit I., S. Naraid and T. Chutima, 2012. Multiplex PCR for simultaneous detection of Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae and Lactococcus garvieae: a case of Streptococcus agalactiae infection in cultured Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis niloticus x Oreochromis mossambicus). Songklanakarin Journal of Science and Technology. 34 (5): 495-500.

Agnew, W. and Barnes, A.C., 2007. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Veterinary Microbiology. Vol.122: 1-15.

Bartie, K., D.T.H. Oanh, G.Huy, C.Dickson, M. Cnockaert, J.Swing, N.T.Phương and A. Teale, 2006. Ứng dụng REP-PCR và PFGE để định type vi khuẩn kháng chloramphenicol 196 phân lập tại các trại nuôi thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Công nghệ sinh học, 4(1): 31-40.

Channarong, R., K. Pattanapon, P. Nopadon, W. Janenuj, 2012. Duplex PCR for simultaneous and unambiguous detection of Streptococcus iniae and Streptococcus agalactiae associated with Streptococcosis of Cultured Tilapia in Thailand. Thai Veterinary Medicine. 42(2): 153-158

Dương Thành Long, 2013. Thử nghiệm quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.). Luận văn cao học ngành nuôi trồng Thủy sản. Khoa Thủy sản. Đại học Cần Thơ.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012a. Phân lập và xác định đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus agalactiae từ cá điêu hồng (Oreochromis sp.) bệnh phù mắt và xuất huyết. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 22c: 203-212.

Đặng Thị Hoàng Oanh, Trương Quỳnh Như và Nguyễn Đức Hiền, 2012b. Phân lập và xác định khả năng gây bệnh xuất huyết trên cá rô đồng (Anabas testudineus) của vi khuẩn Streptococcus agalactiae. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 22c: 194-202.

Fadaeifard, F., M. Raissy, H. Momtaz and Zahedi, 2011. Detection of Streptococcus iniae by polymerase chain reaction in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in west Iran. African Joumal of Microbiology. (5): 4722-4724.

Garcia, J.C., P.H Klesius, J.J Evans, C.A. Shoemarker, 2008. Non-infectivity of cattle Streptococcus agalactiae in Nile tilapia, Oreochromis nilotic and channel catfish, Ictalurus punctatus. Aquaculture. 281: 151-154

Jafar, Q.A., A. Sameer, A. Salwa, A. Samee, A. Ahmed and A. Faisai, 2009. Molecular investigation of Streptococcus agalactiae isolates from environment samples and fish specimens during a massive fish kill in Kuwait Bay. African Joumal of Microbiology Research. 3(1): 022-026.

Mata, A.I., M.M. Blanco, L. Dominguez, J.F. Fernandez-Gagayzabal, Alicia Gibello, 2004. Development of a PCR assay for Streptococcus iniae based on the lactate oxidase (lctO) gene with potential diagnostic value. Veterinary Microbiology. 101: 109- 116.

Ngô Minh Phương, 2014. Rapid detection of Streptococcus iniae red tilapia (Oreochromis sp.) tissue by PCR. Luận văn tốt nghiệp đại học. Ngành Nuôi trồng thủy sản. Khoa Thủy sản. Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Bảo Trung, Trần Hữu Tính, Trần Thị Tuyết Hoa và Từ Thanh Dung, 2013. Phân lập, định danh và xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn Streptococcus iniae trên cá chẽm (Lates calcarifer). Kỷ yếu hội nghị Khoa học trẻ ngành Thủy sản toàn quốc lần thứ IV: 401-405.

Nguyễn Thu Dung và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2013. Đặc điểm bệnh học của bệnh xuất huyết trên cá kèo (Pseudapocryptes elongates) nuôi thương phẩm. Kỷ yếu Hội nghị khoa học trẻ ngành Thủy sản toàn quốc lần thứ IV: 209-215.

Phạm Hồng Quân, Hồ Thu Thủy, Nguyễn Hữu Vũ, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Khoa, 2013. Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Streptococcus spp. Gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi tại một số tỉnh miền bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 11(4): 506-513.

Từ Thanh Dung, Huỳnh Thị Ngọc Thanh và Nguyễn Khương Duy, 2013. Streptococcus iniae, tác nhân gây bệnh “đen thân” trên cá rô đồng (Anabas testudineus). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 26: 96-103

Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 2005. Cơ sở di truyền và công nghệ gen. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 179 trang.

Trần Thị Tuyết Hoa, Dương Thành Long và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2014. Phát triển quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae trực tiếp từ mô cá điêu hồng. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 35: 121-127

Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải, 2008. Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA. Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội. 494 trang.

Romalde, J. L., B. Magarinos, C. Ravelo and A.E.Toranzo, 2009. Vaccination strategies to prevent Streptococcal infections in cultured fish. In: G. Zaccone, C. Perrietre, A. Mathis and B.G. Kapoor (Editior). Fish Defenses Vol (2). Pathogens, Parasites and predators. Science publishers. 403 pp.