QUI TRÌNH RT-PCR PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HOẠI TỬ CƠ (INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS-IMNV) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (PENAEUS VANNAMEI)

Abstract

Research has optimized the PCR procedure with suitable chemical components, thermal cycling conditions to detect infectious myonecrosis virus in whiteleg shrimp. Research focused to optimise PCR step 2 with the identified PCR master mixture including 1X PCR buffer, 1.0 mM MgCl₂, 200 mM dNTPs, 0.465 ?M primers NF and 0.465 ?M primers NR, 2.0U Taq polymerase and 1^st step PCR product. Thermal cycling conditions included initial denaturation at 95°C for 2 min, followed by 35 cycles of 95°C for 30 seconds, 65°C for 20 seconds, 72°C for 30 seconds and final extension step at 72°C for 7 min. Total amplification time was about 2 hours. This assay was demonstrated to have good sensitivity and specificity for detection of infectious myonecrosis virus in extracted RNA from shrimp.

Tóm tắt

Nghiên cứu đã xác định được qui trình PCR với thành phần hóa chất, điều kiện chu kỳ nhiệt thích hợp để phát hiện virus gây hoại tử cơ trên tôm
thẻ chân trắng. Nghiên cứu tập trung tối ưu hóa bước 2 của qui trình
với các thành phần phản ứng được xác định bao gồm đệm PCR 1X; MgCl₂ 1,0 mM; dNTPs 200?M; mồi NF 0,465?M và mồi NR 0,465 ?M, Taq polymerase 2,0U; mẫu PCR bước 1. Điều kiện nhiệt độ bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95^oC trong 2 phút tiếp theo 35 chu kỳ 95^oC trong 30 giây, 65^oC trong 20 giây, 72^oC trong 30 giây, 72^oC trong 7 phút. Tổng số thời gian khuếch đại là khoảng 2 giờ. Độ nhạy và độ chuyên biệt của phản ứng phát hiện IMNV cho kết quả tốt với các mẫu ARN chiết tách từ tôm.