Trần Thị Tuyết Hoa * Trần Thị Mỹ Duyên

* Tác giả liên hệ (ttthoa@ctu.edu.vn)

Abstract

Research has optimized the PCR procedure with suitable chemical components, thermal cycling conditions to detect infectious myonecrosis virus in whiteleg shrimp. Research focused to optimise PCR step 2 with the identified PCR master mixture including 1X PCR buffer, 1.0 mM MgCl2, 200 mM dNTPs, 0.465 ?M primers NF and 0.465 ?M primers NR, 2.0U Taq polymerase and 1st step PCR product. Thermal cycling conditions included initial denaturation at 95°C for 2 min, followed by 35 cycles of 95°C for 30 seconds, 65°C for 20 seconds, 72°C for 30 seconds and final extension step at 72°C for 7 min. Total amplification time was about 2 hours. This assay was demonstrated to have good sensitivity and specificity for detection of infectious myonecrosis virus in extracted RNA from shrimp.
Keywords: RT-PCR, IMNV, Penaeus vannamei, detection

Tóm tắt

Nghiên cứu đã xác định được qui trình PCR với thành phần hóa chất, điều kiện chu kỳ nhiệt thích hợp để phát hiện virus gây hoại tử cơ trên tôm
thẻ chân trắng. Nghiên cứu tập trung tối ưu hóa bước 2 của qui trình
với các thành phần phản ứng được xác định bao gồm đệm PCR 1X; MgCl2 1,0 mM; dNTPs 200?M; mồi NF 0,465?M và mồi NR 0,465 ?M, Taq polymerase 2,0U; mẫu PCR bước 1. Điều kiện nhiệt độ bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95oC trong 2 phút tiếp theo 35 chu kỳ 95oC trong 30 giây, 65oC trong 20 giây, 72oC trong 30 giây, 72oC trong 7 phút. Tổng số thời gian khuếch đại là khoảng 2 giờ. Độ nhạy và độ chuyên biệt của phản ứng phát hiện IMNV cho kết quả tốt với các mẫu ARN chiết tách từ tôm.
Từ khóa: RT-PCR, IMNV, Penaeus vannamei, phát hiện

Article Details

Tài liệu tham khảo

Bartlett JM, Stirling D(2003). A short history of the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol.226:3-6.

Innis, M A and Gelfand, D H (1990). Optimization of PCRs, in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., Innis, M. A., and White, H.,eds.), Academic Press, San Diego, CA, pp. 3–12.

Khuất Hữu Thanh (2006). Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 270 trang.

Lightner DV (1996). A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp Baton Rouge, LA: World Aquaculture Society.

Lightner DV, Pantoja CR, Poulos BT, Tang KFJ, Redman RM, Pasos de Andrade T, Bonami JR (2004). Infectious myonecrosis: new disease in Pacific white shrimp. Global Aquacult Advocate 7:85

OIE (Office International des Epizooties) (2009). Manual of diagnostic tests for aquatic animals, 4th edn. Office International des Epizooties, Paris

Poulos BT and Lightner DV (2006). Detection of infectious myonecrosis virus (IMNV) of penaeid shrimp by reverse-transcriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR). Dis. Aquat. Org., 73 69.

Poulos BT, Tang KFJ, Bonami JR, Lightner DV (2006) Purification and characterization of infectious myonecrosis virus of penaeid shrimp. J Gen Virol 87:987–996

Senapin S, Phewsaiya K, Briggs M, Flegel TW (2007) Outbreaks of infectious myonecrosis virus (IMNV) in Indonesia confirmed by genome sequencing and use of an alternative RT-PCR detection method. Aquaculture 266:32-38.

Senapin S, Phiwsalya, K, Gangnonngiw W and Flegel T.W. (2011). False rumours of disease outbreaks caused by infectious myonecrosis virus (IMNV) in the whiteleg shrimp in Asia. J. Negat. Results Biomed, 10.