Isolation and selection of animal fur and feather degrading bacteria from animal slaughter-house in Vinh Long

Quach Thi Thanh Tam * and Bui Thi Minh Dieu

* Corresponding author (quachtamduy@gmail.com)

Article Sidebar

Full Text: PDF

Received: 08 May 2015
Accepted: 21 Dec 2015
Published: 30 Dec 2015
Title: Isolation and selection of animal fur and feather degrading bacteria from animal slaughter-house in Vinh Long
Views
230
Downloads
79
How to Cite
Tâm, Q. T. T., & Diệu, B. T. M. (2015). Isolation and selection of animal fur and feather degrading bacteria from animal slaughter-house in Vinh Long. CTU Journal of Science, (41), 1-11. Retrieved from https://ctujsvn.ctu.edu.vn/index.php/ctujsvn/article/view/2208
Issue
No. 41 (2015)
Section
Biotechnology

Abstract

Every year, there are thousands of tons of livestock and poultry hair waste that have not been processed in Vietnam. The keratin is the main structural component of animal hair quite hard to decompose in nature. The aim of this study was to isolate and screen keratin degrading bacteria from waste samples collected from animal slaughter-house. These samples were serially diluted and plated on pig-hair-containing medium for isolating and screening of efficient hair-degrading bacteria. The forty seven isolates showed their animal-hair-degrading ability with most of them presented white color colonies were selected. All isolates got keratinase with azokeratin substrate reaction at 50oC for 15 minutes. Strain Kr42 had the highest keratinase activity with 114.3 U/ml. The isolates designated as Kr11, and Kr45 revealed significant differences among differentials with the highest rates as 37.66% and 29.41%, respectively in animal-hair-degrading ability. In feather-containing medium, Kr45 was the best with 72.79% of degrading rates. Bergey’s method and the modern method of 16S rRNA gene sequences indicated that the isolate Kr11 was closely related to Bacillus flexus and the isolate Kr45 was closely correlated to Bacillus megaterium.
Keywords: Azokeratin, Bacillus flexus, Bacillus megaterium, keratin

Tóm tắt

Hàng năm, tại Việt Nam có hàng ngàn tấn lông gia súc, lông gia cầm thải ra môi trường mà chưa được xử lý. Keratin là thành phần cấu tạo chính của lông gia súc, gia cầm và là hợp chất rất khó bị phân hủy trong tự nhiên. Vì vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy mạnh các loại cơ chất chứa keratin này từ mẫu đất, mẫu lông và nước thải thu ở lò giết mổ gia súc thuộc tỉnh Vĩnh Long. Các mẫu vật được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường chứa bột lông heo như nguồn carbon và nitơ duy nhất để phân lập vi khuẩn. Kết quả phân lập được 47 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông heo với đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục. Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho hoạt tính keratinase với cơ chất azokeratin ở 50°C sau 15 phút phản ứng. Dòng Kr42 có hoạt độ keratinase cao nhất là 114,3U/ml và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn còn lại. Bên cạnh đó, dòng Kr11 và Kr45 cho kết quả phân hủy lông heo tốt nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân hủy lần lượt là 37,66% và 29,41%. Dòng Kr45 có khả năng phân hủy lông gia cầm tốt nhất với tỷ lệ 72,79%. Kết hợp giữa phương pháp định danh của Bergey (John et al, 1994) và phương pháp định danh hiện đại dựa vào trình tự của đoạn gen 16S rRNA đã cho kết luận dòng vi khuẩn Kr11 có quan hệ gần với loài Bacillus flexus và dòng vi khuẩn Kr45 có tương quan gần với loài Bacillus megaterium.
Từ khóa: azokeratin, Bacillus flexus, Bacillus megaterium, keratin

Article Details

References

Hình 3: Khả năng phân hủy bột lông heo của các dòng vi khuẩn

Ghi chú: - ĐC: Mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn.

- Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.

- Các giá trị trung bình ở mỗi thanh có các mẫu tự theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% theo phép thử Duncan.

Kết quả khảo sát (hình 3) cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng phân hủy lông heo sau 7 ngày nuôi cấy với mật số vi khuẩn chủng vào lúc đầu là 4 x 1011 (CFU/ml). Dòng Kr11 cho kết quả phân hủy bột lông heo cao nhất 37,66%, kết quả phân hủy này cao gấp khoảng 34,24 lần so với kết quả phân hủy bột lông heo ở mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn; kế đến là dòng Kr45 với tỷ lệ phân hủy bột lông heo là 29,4% cao gấp 26,73 lần so với tỷ lệ phân hủy bột lông heo ở mẫu đối chứng. Đồng thời, kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy khả năng phân hủy lông heo của hai dòng này khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phép thử Duncan so với mẫu đối chứng và với tất cả các dòng còn lại.

Hình 4: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn

Ghi chú: - ĐC: Mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn.

- Số liệu thống kê trên hình là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.

- Các giá trị trung bình có các mẫu tự theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phép thử Duncan

Hình 4 thể hiện khả năng phân hủy lông gia cầm của 47 dòng vi khuẩn phân lập được. Kết quả khảo sát sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy rằng cả 47 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy lông gia cầm. Dòng vi khuẩn Kr45 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất với tỷ lệ là 72,79%. và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với mẫu đối chứng và với các dòng còn lại.

Kết quả thu được thể hiện khả năng phân hủy lông gia cầm cao hơn hẳn so với khả năng phân hủy lông gia súc hầu như ở tất cả các dòng vi khuẩn tương ứng (Hình 3 và Hình 4), mặc dù chúng được phân lập từ các lò giết mổ gia súc. Điều này cho thấy khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin không chỉ phụ thuộc vào dòng vi khuẩn và hoạt độ enzyme keratinase do chúng tạo ra, mà còn phụ thuộc vào cấu trúc của keratin, chứ không bị ảnh hưởng nhiều từ nguồn phân lập. Sự khác biệt về khả năng phân hủy lông gia cầm và khả năng phân hủy lông heo ở các dòng vi khuẩn cũng có thể là do sự khác biệt về cấu trúc keratin giữa lông gia súc (-keratin) và lông gia cầm (-keratin) cũng như hàm lượng sulfur (cầu nối disulfide) trong hai loại cơ chất này (Akhtar và Edwards, 1997).

Kết quả theo dõi sự làm rụng lông con trên sợi lông gà nguyên của 47 dòng vi khuẩn sau 10 ngày nuôi lắc cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng làm gãy rụng lông con trên sợi lông gà nguyên. Trong đó, dòng Kr45 và dòng Kr11 bắt đầu làm rụng lông con từ ngày thứ ba sau khi chủng và làm rụng toàn bộ lông con sau 10 ngày (chỉ còn lại lông ống) và làm tan rã toàn bộ sợi lông gà sau 10 tuần (Hình 5 và Hình 6). Các dòng còn lại cũng cho thấy khả năng làm rụng lông con từ ngày thứ tư nhưng chưa đến 50% số lông con sau 10 ngày chủng.

Hình 5: Sợi lông gà đã phân hủy sau 10 tuần Hình 6: Sợi lông gà đã phân hủy sau 10 tuần được chủng dòng Kr45 so với đối chứng được chủng dòng Kr11 so với đối chứng

Ghi chú: ĐC- đối chứng : không chủng vi khuẩn

Dòng vi khuẩn Kr11(được phân lập từ mẫu đất ở lò giết mổ bò ở huyện Tam Bình) phân huỷ lông gia súc mạnh nhất và Kr45 (được phân lập từ mẫu lông ở lò giết mổ bò ở huyện Tam Bình) phân hủy lông gia cầm mạnh nhất được chọn để định danh bằng cách kết hợp phương pháp truyền thống theo hệ thống phân loại Bergey và phương pháp hiện đại dựa vào trình tự gen 16S rRNA.

Đặc điểm sinh hoá của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn được khảo sát để định danh theo phương pháp truyền thống với hệ thống phân loại Bergey.

Bảng 2: Kết quả khảo sát đặc diểm của hai dòng vi khuẩn hiếu khí được tuyển chọn

Như vậy, trong 35 nhóm vi khuẩn theo hệ thống phân loại Bergey (John et al., 1994), có 3 nhóm cho kết quả phù hợp nhất là nhóm 18 (nhóm vi khuẩn gram dương hình cầu hoặc hình que hình thành bào tử); nhóm 19 (nhóm vi khuẩn gram dương hình que không hình thành bào tử, thường xuyên) và nhóm 20 (nhóm vi khuẩn gram dương hình que không hình thành bào tử, không thường xuyên).

Vì hai dòng VK được tuyển chọn là nhóm vi khuẩn gram dương có bào tử (Bảng 2), nên chúng thuộc nhóm 18. Dựa vào đặc tính của các nhóm vi khuẩn hình que, có khả năng chuyển động ở Bảng 3 (trích từ John et al., 1994) có thể nhận ra 2 dòng VK này không thuộc nhóm Sporesarcina và nhóm Sulfidobacillus.

Bảng 3: Phân biệt các đặc tính khác nhau giữa các nhóm vi khuẩn có bào tử

Ghi chú : + : dòng dương tính ; - : dòng âm tính ; ND: không xác định

Thực hiện thử nghiệm catalase với hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn đều cho kết quả dương tính với H2O2 và nhóm Bacillus được xem là nhóm phù hợp nhất về các đặc tính sinh hoá của hai dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45.

Kết quả khảo sát đặc điểm của 2 dòng vi khuẩn ở Bảng 2 càng cho thấy rõ nhóm Bacillus là nhóm vi khuẩn phù hợp nhất về các đặc tính sinh hoá của hai dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45.

Trình tự đoạn gen 16S rDNA của hai dòng vi khuẩn trên được xác định bằng phương pháp Sinh học Phân tử. DNA của chúng được ly trích và đoạn gen 16S rRNA được khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 8F và 1391R.

Kết hợp với phương pháp nhận diện dựa vào trình tự gen 16S rRNA: DNA của chúng được ly trích và đoạn gen 16S rRNA được khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 8F và 1391R.

Hình 7: Bọt khí sinh ra khi khảo sát hoạt tính catalase của dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45

Giếng 1: Thang chuẩn 1kp

Giếng 2: mẫu Kr11

Giếng 3: mẫu Kr45

Giếng 4: Đối chứng âm

Hình 8: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose của hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn

(Ngày 12/12/2014)

Bảng 4: Kết quả mối tương quan di truyền các dòng vi khuẩn phân giải keratin phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI)

Kết hợp giữa phương pháp định danh truyền thống Bergey và phương pháp định danh hiện đại dựa vào trình tự đoạn gen 16S rDNA của hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn với trình tự của các dòng vi khuẩn khác ở GenBank cho thấy chúng đều thuộc chi Bacillus, dòng Kr11 có quan hệ gần gũi với Bacillus flexus RB85, dòng Kr45 tương quan gần với dòng Bacillus megaterium AIMST 3.

Như vậy, hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn từ nghiên cứu này đều thuộc chi Bacillus. Kết quả này phù hợp với kết luận của Ghosh et al. (2007) là phần lớn các dòng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy keratin cao phân lập được đều thuộc chi Bacillus. Dòng Bacillus megaterium F7-1 đã được Geun - Tea Park và Hong – Joo Son nghiên cứu và cho thấy khả năng phân hủy đến 26% lượng bột lông gà sau 24 giờ chủng ở 30°C.

Từ chất thải lò giết mổ gia súc đã phân lập được vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc (lông heo) và lông gia cầm. Khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin không chỉ phụ thuộc vào hoạt tính keratinase mà còn phụ thuộc vào các yếu tố khác (có thể là tế bào vi khuẩn và kiểu cấu trúc keratin, Edward et al., 2001). Trong thí nghiệm, hai dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông heo mạnh (Bacillus flexus Kr11) và lông gia cầm mạnh (Bacillus megaterium Kr45) đều thuộc chi Bacillus, kỳ vọng ứng dụng để xử lí rác thải chứa keratin. Dòng vi khuẩn Kr45 liên quan gần với loài Bacillus megaterium với khả năng phân hủy cọng lông gà nguyên hoàn toàn sau 10 tuần có tiềm năng đưa vào thử nghiệm ứng dụng phân hủy lông gia cầm ở điều kiện môi trường tự nhiên để làm thức ăn chăn nuôi.

LỜI CẢM TẠ

Tác giả xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thực hiện nghiên cứu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Akhtar W. and H.G.M. Edwards, 1997. Fourier-transform Raman spectroscopy of mammalian and avian keratotic biopolymers. Spectrochim Acta. 53: 81-90.

Barker G.C., J.J.Smith and D.A. Cowan, 2003. Review and reanalysis of domain specific 16S primers. Journal of Microbiological Method. 55: 541-555.

Daniel J.D., Ana P.F.C. and Brandelli A, 2009. Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp. P45 isolated from the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicus. International Biodeterioration & Biodegradation. 63: 358–363.

Edward H.Burtt, Jr. and Jann M.Ichida, 2001. Bacteria useful for degrading keratin. United States Patent.

Ghosh A., Maity B., Chakrabarti K. and Chattopadhyay D, 2007. Bacterial diversity of east Calcutta wet land area: Possible identification of potential bacterial population for different biotechnological uses. Microbial Ecology. 54: 452-459.

Gupta, R. and P. Ramnani, 2006. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl Microbiol Biotechnol, 70:21–33.

Mohammad, S. H., K. A. Abul, S. M. Abu Sayem, M. Golam and H.Mozammel, 2007. Production and Partial characterization of feather-degrading keratinolytic serine protease from Bacillus licheniformis MZK-3. J.Biological Sciences, 7 (4):599-606.

Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai và Nguyễn Ngọc Dũng. 2010. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản. Toàn văn Hội nghị thủy sản 2010.

Savitha S. Desai, Swati Hegde, Preeti Inamdar, Nagaraj Sake and M. S. Aravind, 2010. Isolation of keratinase from bacterial isolates of poultry soil for waste degradation, International Journal of Engineering in Life Sciences, Volume 10, Issue 4, pages 361–367.

John G. Holt, Peter H.S. and Nobel R.K., 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, ninth edition. Lippincott Williams and Wilkins, United States, 9-754 pp.

Joshi S.G., Tejashwini M.M., Revati N., Sridevi R. and Roma D.,2007. Isolation, identification and characterazation of a feather degrading bacterium. International Journal of Poultry Science. 6(9): 689-693.

Park Geun.Tea and Hong-Joo Son, 2009. Keratinolyticactivity of Bacillus megaterium F7-1, a feather-degradingmesophilicbacterium. Microbiological Research, 164: 478-485.

Tapia D.M.T. and J.Contiero, 2008. Production and partial characterization of keratinase produced by a microorganism isolated from poultry processing plant wastewater. African Journal of Biotechnology. 7(3): 296-300.