PHÂN LẬP VÀ NHẬN DANH CẤU TRÚC HAI FLAVONOL TỪ DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA CÂY CỎ LÀO-EUPATORIUM ODORATUM L.
Article Sidebar
Full Text: 
PDF
Abstract
Tóm tắt
Article Details
References
* Xăng dung môi hay dung môi cao su, một loại petroleum ether có khoảng sôi 79-96C
Phương pháp nhận dạng cấu trúc
Điểm tan chảy được đo trên máy Electrothemal 9100 (U.K), mao quản không hiệu chỉnh. Phổ hồng ngoại được đo trên máy VECTOR 22, dùng viên nén KBr. Phổ UV-VIS được do trên máy UV-2450 (Japan).
Các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz, độ dịch chuyển hóa học () được tính theo ppm, hằng số tương tác (J) tính bằng Hz. Phổ khối lượng được đo trên máy 1100 series LC/MS Trap Agilent, sắc ký lớp mỏng sử dụng bản nhôm silica gel 60F254 (Merck) tráng sẵn độ dày 0,2 mm.
Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn phương pháp gốc tự do bền DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) như sau:
Hòa tan chất tinh khiết trong DMSO ở nồng độ: 500 μg/ml.
DPPH hòa tan trong dung môi ethanol ở nồng độ 250μM.
Cho 8 ml dung dịch DPPH nồng độ 250μM phản ứng với 2 ml dung dịch chất tinh khiết nồng độ 500 μg/ml.
Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm.
Dãy chuẩn và mẫu trắng được thực hiện trong điều kiện tương tự như trên.
LA2-2 kết tinh trong EtOAc thu được chất rắn dạng bột, màu vàng rơm, có nhiệt độ nóng chảy mp = 217-218ºC (EtOAc), sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi (PE: EtOAc = 1:1), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH cho vết màu da cam có Rf = 0,39.
Phổ 1H-NMR, (DMSO, ppm) cho 8 mũi tín hiệu proton:
+ 1 mũi đơn tại 3,86: 3 proton của 1 nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene.
+ 4 mũi trong khoảng 6,34-8,09 là tín hiệu của các proton của nhóm CH kề nối đôi, cho thấy có 2 vòng benzene, trong đó:
* Vòng A: 2 proton ghép cặp meta tại 6,35 (1H, d, J= 2,0 Hz) và 6,74 (1H, d, J= 2,0 Hz).
* Vòng B: 2 mũi đôi là 4 proton cho biết có 2 cặp proton ở vị trí đối xứng nhau trên vòng benzene nên 2 cặp proton đó tương đương độ dời hóa học, chúng ghép cặp orto tại 8,08 (1H, d, J= 8,5 Hz) và 6,92 (1H, d, J= 9,0 Hz).
+ 1 mũi đơn tại 12,47: 1 proton của nhóm OH.
+ 2 mũi đơn còn lại tại 9,49 và 10,11 có thể là 2 proton của 2 nhóm OH.
Vậy LA2-2 có tất cả 12 proton.
Các phổ 13C-NMR (DMSO, ppm) cho thấy chất LA2-2 có 14 mũi tín hiệu carbon.
+ 8 mũi trong khoảng 104,01-164,88: 8 carbon tứ cấp (104,01; 121,56; 135,94; 147,23; 156,07; 157,27; 160,35; 164,88).
+ 1 mũi tại 55,99: 1 carbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene.
+ 1 mũi tại 176,00: 1 carbon của nhóm C=O đặc trưng của hợp chất flavone.
+ 4 mũi trong khoảng 91,99-129,55: 6 carbon loại CH kề nối đôi
( 91,99; 97,43; 115,43; 129,55).
Vậy LA2-2 có tất cả 16 nguyên tử carbon (trong đó có 2 cặp carbon tương đương độ dời hóa học).
Căn cứ vào các đặc tính phổ NMR của LA2-2 có thể dự đoán chất này có khung flavone. Ngoài 5 nguyên tử oxy đã xuất hiện theo các nhóm trên phổ NMR, LA2-2 còn có thêm 1 nguyên tử oxy. Vậy LA2-2 có 6 nguyên tử oxy.
Như vậy, LA2-2 có công thức phân tử là C16H12O6, phân tử khối là 300 đvC; độ bất bão hòa là 11, trong đó: vòng pyron chiếm 4 độ bất bão hòa, vậy còn 7 độ bất bão hòa có thể là của 2 vòng benzene (1 vòng ghép 1 cạnh với vòng pyron và 1 vòng gắn với vòng pyron qua dây nối), phù hợp với cơ cấu khung flavone (Hình 5).
Qui nạp các độ dời hóa học vào các vị trí trên khung flavone (Bảng 1) và kiểm tra lại bằng các phổ hai chiều HMBC (DMSO, ppm) cho thấy sự tương tác giữa H với C tại các vị trí C mà H có thể tương tác: H6C6, C8, C10, C5, C7; H8C8, C6, C10, C9, C7, H2′C2′, C6′, C2, C4′; H3′C3′, C5′, C1′, C4′ ; H5′C5′, C1′, C3′, C4′; H6’C6′, C2′, C2, C4′ ; 7OCH3C7; 5-OHC6, C10, C5.
Bảng 1: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, và HMBC của LA2-2
Tóm lại, dựa vào các kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố (David S. Seigler and E. Wollenweber, 1983; Maria Rose Jane R. Albuquerque et al., 2006), chúng tôi nhận danh chất LA2-2 là rhamnocitrin (7-O-methylkaempferol hay 3,5,4’- trihydroxy-7-methoxyflavone) có công thức cấu tạo như hình 5.
<Object: word/embeddings/oleObject1.bin><Object: word/embeddings/oleObject2.bin>
Hình 5: Công thức cấu tạo của LA2-2
LA6-9 kết tinh trong MeOH thu được chất rắn dạng bột, màu vàng nghệ, có nhiệt độ nóng chảy mp = 263-264ºC (MeOH), sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi (PE: EtOAc = 1:1), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH cho vết màu da cam có Rf = 0,21.
Phổ 1H-NMR, (DMSO, ppm) cho 8 mũi tín hiệu proton:
+ 1 mũi đơn tại 3,86: 3 proton của 1 nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene.
+ 5 mũi trong khoảng 6,34-7,72 là tín hiệu của các proton của nhóm CH kề nối đôi, trong đó:
* 3 mũi đơn: 3 proton (6,33; 6,68; 7,71).
* 2 mũi đôi: 2 proton ghép cặp orto tại 6,88 (1H, d, J= 8,5 Hz) và 7,57 (1H, d, J= 8,0 Hz).
+ 1 mũi đơn tại 12,47: 1 proton của nhóm OH.
+ 1 mũi rộng tại 9,43 có thể là 3 proton của 3 nhóm OH.
Vậy LA6-9 có tất cả 12 proton.
Phổ 13C-NMR (DMSO, ppm) cho thấy chất LA6-9 có 16 mũi tín hiệu carbon.
+ 9 mũi trong khoảng 103,99-164,89: 9 carbon tứ cấp (103,99; 121,87; 136,01; 145,07; 147,29; 147,83; 156,06; 160,37; 164,89).
+ 1 mũi tại 56,00: 1 carbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene.
+ 1 mũi tại 175,95: 1 carbon của nhóm C=O đặc trưng của hợp chất flavone.
+ 5 mũi trong khoảng 91,88-120,04: 5 carbon loại CH kề nối đôi
(91,88; 97,42; 115,24; 115,57; 120,04).
Vậy LA6-9 có tất cả 16 nguyên tử carbon
Căn cứ vào các đặc tính phổ NMR của LA6-9 có thể dự đoán chất này có khung flavone. Ngoài 6 nguyên tử oxy đã xuất hiện theo các nhóm trên phổ NMR, LA6-9 còn có thêm 1 nguyên tử oxy. Vậy LA6-9 có 7 nguyên tử oxy.
Như vậy, LA6-9 có công thức phân tử là C16H12O7, phân tử khối là 316 đvC; độ bất bão hòa là 11, trong đó vòng pyron chiếm 4 độ bất bão hòa, vậy còn 7 độ bất hòa có thể là của 2 vòng benzene (1 vòng ghép 1 cạnh với vòng pyron và 1 vòng gắn với vòng pyron qua dây nối), phù hợp với cơ cấu khung flavone (Hình 6).
Qui nạp các độ dời hóa học vào các vị trí trên khung flavone (Bảng 2) và kiểm lại bằng các phổ hai chiều HSQC và HMBC:
Phổ hai chiều HSQC (DMSO, ppm) cho thấy sự tương tác giữa H với C tại vị trí C mà H gắn vào: H6C6; H8C8; H2′C2′; H5′C5′; H6′C6′.
Phổ hai chiều HMBC (DMSO, ppm) cho thấy sự tương tác giữa H với C tại các vị trí C mà H có thể tương tác: H6C6, C8, C10, C5, C7; H8C8, C6, C10, C2, C7; H2′C2′, C6′, C3′, C4′; H5′C5′, C1′, C3′, C4′; H6’C6′, C2′, C4′ ; 7OCH3C7; 5-OHC6, C10, C5.
Bảng 2: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC của LA6-9
Tóm lại, dựa vào các kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố (Toan Thang Phan, Lingzhi Wang, Patrick See, Renee Jacqueline Grayer, Sui Yung Chan and Seng Teik Lee, 2001), chúng tôi nhận danh chất LA6-9 là rhamnetin (7-methoxyquercetin hoặc 3,5,3’,4’-tetrahydroxy-7-methoxyflavone) có công thức cấu tạo như hình 6.
<Object: word/embeddings/oleObject3.bin><Object: word/embeddings/oleObject4.bin>
Hình 6: Công thức cấu tạo của LA6-9
Bảng 3: Độ hấp thu của hệ phản ứng giữa chất tinh khiết và DPPH
Bảng 4: Giá trị % ức chế Q của các cao chiết và các chất tinh khiết
Các kết quả nghiên cứu trên đây cho thấy từ Cỏ Lào Phú Yên đã cô lập được thêm hai flavonol thuộc nhóm hợp chất flavonoid là rhamnocitrin (3,5,4’-trihydroxy-7-methoxyflavone) và rhamnetin (3,5,3’,4’-tetrahydroxy-7-methoxy-flavone). Hai chất này có tính kháng oxi hóa mạnh tương đương nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Apichart Suksamrarn, Apinya Chotipong, Tananit Suavansri, Somnuk Boongird, Puntip Timsuksai, Saovaluk Vimuttipong and Aporn Chuaynugul, 2004. Antimycobacterial activity and cytotoxicity of flavonoids from the flowers of Chromolaena odorata. Arch Pharm Res, Vol. 27, No. 5, pages 507-511.
David S. Seigler and E. Wollenweber, 1983. Chemical variation in Notholaena standley. Amer.J.Bot., 70 (5), pages 790-798.
Maria Rose Jane R. Albuquerque et al., 2006. Terpenoids, Flavonoids and other constituents of Eupatorium betonicaeforme (Asteraceae). J. Braz. Chem. Soc., Vol. 17, No. 1, pages 68-72.
Ngô Quốc Luân, Lâm Thanh Phong, Nguyễn Ngọc Hạnh, 2006. Một số kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu và flavonoid trong cây Cỏ Lào. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, Số 6-2006, trang 103-110.
Ngô Quốc Luân, Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Ngọc Hạnh, 2007. Phân lập và nhận danh cấu trúc một chalcone từ dịch chiết ethyl acetatecủa cây Cỏ Lào- Eupatorium odoratum L. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, Số 8-2007, trang 16-20.
Nguyễn Thị Ngọc Tú, Lê Thị Hải Yến, 2000. Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của một số thành phần trong cao Cỏ Lào. Tạp chí Dược học, Số 7, trang 17-19.
R.N. Barua, R. P. Sharma, G. Thyagarajan, Werner Hertz, 1978. Flavonoids of Chromolaena odorata. Phytochemistry, Vol 17, pages 1807-1808.
Toan Thang Phan, Lingzhi Wang, Patrick See, Renee Jacqueline Grayer, Sui Yung Chan and Seng Teik Lee, 2001. Phenolic Compounds of Chromolaena odorata Protect Cultured Skin Cells from Oxidative Damage: Implication for Cutaneous Wound healing. Biol. Pharm. Bull, Vol 24, issue 12, pages 1373-1379.